碱基编辑器（Base editor,BE）是一类可以在不产生双链DNA断裂的基础上高效催化碱基转换，在生物研究、农业育种、基因治疗领域展现极大的潜力。由于单核苷酸变异(SNV)在疾病相关的突变中占据了近60%，因此，开发高效精确的碱基编辑工具对于人类遗传疾病的治疗具有重大意义。目前，碱基编辑器主要包括腺嘌呤碱基编辑器（Adenine base editor，ABE）和胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor，CBE)，它们是将Cas9缺口酶（nickase）分别与腺嘌呤脱氨酶和胞嘧啶脱氨酶融合，实现A-to-G和C-to-T转换。然而，腺嘌呤碱基编辑器在靠近PAM区编辑活性仍然较低。此外，可编辑两种碱基底物的双碱基编辑器的转换效率仍然比较低，极大地限制了碱基编辑器的广泛应用。因此，开发超高活性的单碱基编辑器和双碱基编辑器极为迫切。
2023年3月3日，best365体育官网登录入口/上海市基因编辑与细胞治疗前沿科学基地张晓辉（现为中国医学科学院苏州系统医学研究所PI）、钟涛和李大力，在《自然通讯》杂志上发表了题为 “Improving adenine and dual base editors through introduction of TadA-8e and Rad51DBD” 的科学论文。开发了具有超高活性的腺嘌呤单碱基编辑器 （hyABE）,极大地提高了靠近PAM区A-to-G的转换效率，扩大了编辑窗口。同时，作者又研发了超高活性的嘌呤嘧啶双碱基编辑器（eA&C-BEs和hyA&C-BEs）,大幅提高A-to-G和C-to-T（A/C）同时编辑效率，并首次证明在斑马鱼胚胎中具有A/C同时编辑功能，展现了新型腺嘌呤碱基编辑器 hyABE在构建点突变疾病模型中的优势。
研究人员首先在ABEmax和ABE8e上融合单链DNA结合蛋白Rad51DBD,测试了不同的融合策略，发现ABE8e-M-Rad51DBD(hyABE)具有最优编辑功能。虽然hyABE在A2-A9与ABE8e有着相似的编辑效率，但hyABE的编辑效率在A10-A15区间高于ABE8e，可达7倍 。此前研发的双碱基编辑器(A&C-BEmax)实现A-to-G和C-to-T（A/C）同时编辑，但效率较低，可能是使用TadA-TadA*的原因。作者将其替换为活性更高的TadA8e，研发出eA&C-BEmax, 发现A-to-G的编辑效率平均提高1.1-10.1倍，A/C同时编辑的效率提升了1.8倍，而C-to-T的编辑效率在靠近PAM区与A&C-BEmax持平。为了进一步提高A/C同时编辑效率,在eA&C-BEmax上融合Rad51DBD，发现hyA&C-BEmax双碱基编辑器A-to-G的编辑效率提升了1.2-17.7倍，C-to-T的编辑效率高于eA&C-BEmax，A/C同时编辑效率提升1.9倍 。在脱靶方面，作者通过三个方面（Cas9依赖DNA脱靶，Cas9非依赖DNA脱靶和RNA脱靶）鉴定hyABE,eA&C-BE 和hyA&C-BE安全性，发现相对于经典的ABE8e 和 A&C-BE， hyABE,eA&C-BE 和hyA&C-BE并不展示更高的脱靶效应，说明优化后碱基编辑具有较高的特异性。
为了构建疾病模型，研究人员在斑马鱼胚胎中试验基因靶点编辑，发现hyABE有效催化A-to-G 转换，编辑效率高达60%。惊奇的是，能够在F0胚胎中引入纯合rps14E12G致病点突变，显著降低血红蛋白和红细胞数目，成功构建了血细胞发育异常（MDS）疾病模型，展现了hyABE在构建点突变疾病模型中的优势 。同时，证明双碱基编辑器 eA&C-BEs 和hyA&C-BEs 在斑马鱼胚胎中具有较高的A-to-G 和 C-to-T 同时转换效率。这些碱基编辑器的应用并没有引起斑马鱼胚胎发育致畸表型。作者进一步将hyABE应用到b-血红蛋白病的基因治疗中，将其递送到红细胞前体细胞中(HUDEP-2)，创建新的转录激活因子GATA1结合位点（-113 A>G）以及新的KLF1/EKLF结合位点(-198 T>C),重新激活γ-globin的表达，提供潜在的基因治疗新策略。
图一. 新型碱基编辑器在斑马鱼胚胎和人类红细胞中构建血红蛋白缺陷疾病模型
best365体育官网登录入口硕士研究生薛念念，博士研究生刘旭，博士后张丹，中国医学科学院苏州系统医学研究所博士研究生吴友明为该论文的共同第一作者，苏州系统医学研究所张晓辉研究员，我校钟涛教授，李大力教授为本文通讯作者。本项目获得上海市教委前沿科学基地项目、科技部重点研发计划以及国家自然科学基金的支持。